亲子鉴定做突变验证时，Sanger测序需要双向测通吗？

血缘关系的认定，从古至今始终是人类社会关注的核心议题。在当代科学技术的发展推动下，亲子鉴定已从传统的伦理判断，转变为集精密性、规范性和法律效力于一体的专业技术体系。其本质在于对生命最基础的遗传物质——DNA——进行科学严谨的比对分析。这不仅是一项专业的实验室检测工作，更是一套完整严密的操作规程，从样本采集的初始环节到最终鉴定报告的正式出具，每个步骤都直接影响着检测结果的精确性和结论的客观公正性。

一、亲子鉴定核心技术原理

现代亲子鉴定主要基于DNA分型技术，其核心在于比对分析个体间特定遗传标记（STR位点）的匹配程度。

人类遗传基础：

除同卵**外，每个人的DNA序列都具有独特性。子女的遗传物质一半源自生物学父亲，一半来自生物学母亲。

STR位点解析：

即短串联重复序列，指DNA上特定区域存在的重复碱基序列（如"AGAT"重复多次）。不同个体在同一STR位点上的重复次数往往存在差异。

分型检测技术：

通过聚合酶链式反应（PCR）对样本DNA中的特定STR位点片段进行扩增，再运用毛细管电泳等技术精确测定各STR位点的片段长度（即重复次数），从而构建个体的DNA遗传图谱。

亲缘关系判定标准：

将被检测儿童（C）的DNA图谱与假定父亲（AF）和/或假定母亲（AM）的图谱进行比对分析。在每个检测的STR位点上，孩子必须继承一个来自生父的等位基因和一个来自生母的等位基因。通过统计学方法计算亲权指数（PI）和累积亲权指数（CPI），最终得出亲权概率（RCP）。通常要求RCP≥99.99%才能确认亲子关系。

二、标准化技术操作流程

（一）样本采集（关键第一步）

1、人员准备：

确认所有参与者的身份（司法鉴定需核对证件原件）。

签署知情同意书（司法鉴定需按手印）。

采集人员需佩戴干净手套，必要时佩戴口罩、帽子。

2、常用样本类型与采集方法：

口腔拭子（最常用、无创、推荐首选）：

请被采样人清水漱口（半小时内勿进食饮水）。

取出无菌医用棉签，紧握棉签杆，将棉签头在口腔内壁（脸颊内侧）用力旋转刮擦至少20-30次，确保充分接触粘膜细胞。同法采集另一侧。

将棉签垂直放置在清洁的采样卡或干净白纸上，自然晾干（避免阳光直射、热源烘烤，切勿用嘴吹）。

完全干燥后（通常需30-60分钟），放入干净的纸质信封袋，标记清晰信息（姓名、采样日期、关系如“子”、“父”等）。切勿使用塑料袋密封，以防霉变。

关键点：避免棉签接触其他物品；确保充分刮擦获得足够细胞；彻底干燥是防止霉变降解的关键。

静脉血（司法鉴定常用）：

由专业医护人员操作。

常规消毒穿刺部位，抽取适量静脉血（通常2-5mlEDTA抗凝血）。

轻轻颠倒混匀抗凝管数次。

标记清楚，按机构要求保存（通常4℃冷藏）和运输。

血痕样本：

消毒指尖（或耳垂），用一次性采血针轻刺。

取3-5滴血液（每滴约黄豆大小）滴在专用采血卡（如FTA卡）或干净滤纸上。

自然晾干（避免重叠、污染、暴晒、烘烤）。

完全干燥后放入纸质信封袋，标记清楚。

特殊样本（如毛发、烟头、口香糖、精斑等）：

此类样本DNA含量少或易降解，需特殊处理，务必提前咨询鉴定机构确认是否可检及具体要求。

例如毛发：需带有肉眼可见的毛囊（根部白色小囊），至少5-8根。手捏毛干部分取下，勿触碰毛囊。晾干后放入纸袋。

3、样本标记与封装：

每个样本独立包装，在包装袋外清晰、牢固地标记唯一编号、姓名（或代号）、样本类型、采样日期、关系。

所有样本连同填写完整的委托书、身份证明复印件（司法鉴定需要）等一同放入大信封或样本盒。司法鉴定样本需当场封存，当事人及采样人签字/按手印确认。

生物安全：所有样本均视为潜在生物危害物，封装需防泄漏，运输需符合相关生物安全规定。

（二）样本保存与运输

口腔拭子/血痕卡：常温、干燥、避光保存。尽快送检（通常建议采样后一周内送达实验室）。避免高温、高湿、化学污染。

静脉血：需冷藏（2-8℃）保存和运输（冰袋或冷链）。严禁冷冻，否则会溶血破坏细胞。尽快送检（通常建议24-48小时内）。

特殊样本：按机构具体要求保存（如冷冻、干燥等），尽快送检。

运输：选择可靠的快递公司，确保包装牢固、防压、防漏、符合生物安全要求。告知快递内含生物样本。

（三）实验室检测

样本抵达具备资质的实验室后，将经历严格流程：

1、样本接收与登记：核对样本信息、数量、状态（是否污染、霉变、渗漏等），登记入库，分配唯一实验编号。状态异常会联系委托方。

2、DNA提取：在专门的样本制备区进行。

口腔拭子/血痕卡：剪下含样本部分，使用裂解液（含蛋白酶K）消化细胞膜、核膜，释放DNA。

静脉血：离心分离白细胞，裂解释放DNA。

特殊样本：采用针对性方法（如毛囊刮取、精斑浸泡等）提取。

通过离心柱吸附法或磁珠法等纯化DNA，去除杂质（蛋白质、色素、抑制剂等）。

3、DNA定量与质检：使用紫外分光光度计或荧光定量仪测量DNA浓度和纯度（如A260/A280比值），确保提取的DNA质量和数量满足后续PCR扩增要求。

4、PCR扩增：在PCR准备区配置反应体系。

将提取的DNA、引物（特异性识别STR位点两端）、TaqDNA聚合酶、dNTPs（合成原料）、缓冲液等混合。

在PCR仪中进行热循环：变性（高温解链DNA）→退火（引物结合到模板）→延伸（合成新链）。经过约30个循环，目标STR片段被指数级扩增。

5、STR分型检测：在扩增产物分析区进行。

毛细管电泳（主流方法）：将PCR产物与内标（SizeStandard）和去离子甲酰胺混合，上样到毛细管电泳仪。在高电压下，不同长度的DNA片段在毛细管内的聚合物中迁移速度不同。通过激光激发荧光标记（引物上带有不同颜色的荧光染料），检测器记录每个片段的出峰时间和荧光颜色。

数据采集与分析：专业软件将电泳信号转换为数字化的基因图谱，精确读出每个STR位点的等位基因大小（重复次数）。生成包含所有检测位点分型结果的表格。

6、质量控制（贯穿全程）：

阴性对照：不含DNA模板的PCR反应，监测试剂污染。

阳性对照：已知分型的标准品，监测试剂和仪器性能。

内标：确保片段大小判读准确。

实验分区：严格物理隔离（样本制备区、PCR前区、PCR后区、检测区），单向气流，防止扩增产物污染。

人员资质与操作规范：实验人员需经专业培训，严格遵循SOP操作。

（四）数据分析与亲权关系计算

1、数据审核：由技术员和审核员共同复核基因图谱质量及分型结果准确性。

2、三联体分析：

通过比对孩子的STR位点，在排除母亲基因贡献后确定生父基因来源。若假定父亲(AF)未检出必需等位基因，则判定为"排除"。PI值按X/Y公式计算，其中X表示AF提供生父基因的概率，Y表示随机人群携带该基因的概率。

3、二联体分析：

直接分析孩子等位基因是否源自AF。计算PI值时需考虑基因可能来自母亲的情况。

4、CPI计算：将各STR位点的PI值相乘得到CPI值，当CPI≥10000（相当于RCP≥99.99%）时支持亲子关系认定。

5、RCP计算：RCP=CPI/(CPI+1)×100%，反映亲子关系的统计学概率。

6、判定标准：

支持亲子关系：所有检测位点符合遗传规律且CPI≥10000

排除亲子关系：3个或以上位点不符合遗传规律

无法结论：特殊情况需补充检测

（五）报告出具

1、报告内容：

包含机构信息、委托方资料、被鉴定人信息、鉴定方法、试剂盒信息、分型结果、分析说明、鉴定意见、人员签名及机构盖章等内容。

2、报告签发：由授权签字人审核后签发。

三、关键注意事项与局限性

1、资质选择：务必选择具备《司法鉴定许可证》且鉴定范围包含“法医物证鉴定”的机构，特别是用于司法诉讼、上户口、移民等用途。个人隐私鉴定也需确保机构技术可靠。

2、样本真实性：样本必须来自被鉴定人本人。司法鉴定通过现场采样、身份核查、拍照录像等确保。个人委托需自行保证样本来源真实，否则结果无效。

3、污染风险：严格遵守采样要求（戴手套、清洁环境、样本独立包装干燥）。实验室污染控制至关重要。

4、样本质量：样本量不足、保存不当（霉变、高温高湿）、含强抑制剂（如深色布料上的血痕）可能导致DNA提取失败或分型不全。

5、基因突变：极少数情况下，子代可能发生新发突变，导致个别STR位点不符合遗传规律（通常仅1个位点）。需结合CPI值和突变率进行专业分析判断。

6、近亲干扰：若假定父亲与被鉴定孩子的生父有近亲关系（如兄弟），可能导致CPI值升高，甚至错误地不排除亲子关系。怀疑此情况需提前告知机构，可能需要增加检测位点或补充其他亲属样本。

7、技术局限性：现有STR检测技术对同卵**无法区分。对远亲关系（如表亲）的鉴定能力有限，需要更复杂的检测（如SNP测序、Y染色体/线粒体DNA检测）。

8、报告解读：报告结论是概率性判断（支持或排除），非绝对“是”或“不是”。理解CPI和RCP的含义很重要。如有疑问，务必向鉴定机构咨询。

亲子鉴定是建立在现代分子遗传学基础上的精密科学技术，其操作流程高度标准化、规范化，涉及严格的生物安全与质量控制体系。理解其核心原理、关键操作步骤（尤其是样本采集的规范性）以及结果的解读方式（CPI/RCP），对于确保鉴定结果的准确可靠、维护各方合法权益至关重要。无论是出于司法需求还是个人解惑，都应秉持严肃、科学的态度，选择正规、权威的鉴定机构进行委托，并清晰了解其过程与意义。