试管细胞冻存传统步骤在4度中放多久？

试管细胞冻存传统步骤在4度中放多久？试管细胞冻存是一项广泛应用于生物医学领域的技术，主要用于长期保存细胞系或生物样本。这一过程涉及多个步骤，其中每一步都至关重要，以确保细胞在解冻后仍能保持活性和功能。下面详细介绍传统的试管细胞冻存步骤及其在4度条件下的处理时间。

1、细胞准备

培养基更换：在冻存前24小时更换新鲜的完全培养基，确保细胞处于良好的生长状态。

消化与计数：使用胰蛋白酶消化细胞，然后用血球计数板进行细胞计数，选择活力大于90%的细胞用于冻存。

2、冻存液配制

基本成分：通常包含基础培养基（如DMEM）、胎牛血清（FBS）以及保存保护剂（如二甲基亚砜，DMSO）。

比例：常用的配比为90%的培养基加10%的DMSO。

3、细胞悬浮

- 将细胞与冻存液混合，使其浓度达到5-10 × 10^6 cells/mL。

4、慢速降温

程序降温盒：将细胞悬液分装到冻存管中，放入程序降温盒内，并置于-80°C冰箱过夜。程序降温盒内部填充异丙醇或其他冷却介质，有助于实现缓慢降温过程。

手动降温：如果没有程序降温盒，可采用手动降温方法，即将冻存管放入-20°C冰箱约1小时，然后移至-80°C冰箱。

5、短期保存于-80°C

- 在完成上述降温步骤后，将冻存管放置在-80°C冰箱中短期保存。这一步骤通常持续至少24小时，以确保细胞充分冻结。

6、长期保存于液氮罐

- 为了长期保存细胞，需将其转移到液氮罐中。液氮温度约为-196°C，可提供极低温度环境，有效延长细胞保存期限。

7、解冻与复苏

- 当需要使用冻存细胞时，应迅速将冻存管从液氮或-80°C冰箱取出，立即浸入37°C温水中快速解冻，直至冰块完全融化。

- 将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，加入预热的培养基稀释，去除DMSO等保存保护剂，然后进行离心洗涤。

- 最后，将细胞重新接种于培养瓶中，置于CO2培养箱内继续培养。

注意事项

- 整个过程中应严格遵守无菌操作规程，避免污染。

- 冻存过程中温度控制尤为重要，过快或过慢的降温速率均会影响细胞存活率。

- 定期检查液氮罐内液位，确保足够低温环境。

通过上述步骤，可以有效地做试管细胞的冻存及复苏，确保细胞在长时间保存后仍具有较高的活性和功能。