如何解决三代试管活检技术中的细胞获取和质量问题

解决三代试管婴儿（PGT-AS）活检技术中的细胞获取和质量问题是实现成功妊娠的关键环节。PGT-AS活检通常在胚胎培养至囊胚阶段（Day 5或Day 6）进行，主要目标是从滋养层细胞（Trophoblast）中获取足够的、高质量的细胞进行遗传学检测。以下是一些解决细胞获取和质量问题的策略：

一、 提高细胞获取率（Quantity）

1. 优化活检操作技巧：

   • 标准化操作流程： 制定详细、标准化的活检方案，包括胚胎选择标准、麻醉方法、活检针类型和大小、穿刺次数、移液次数等，减少人为误差。
   • 选择合适的活检工具： 根据实验室经验和胚胎特性，选择合适的显微操作工具，如不同直径的显微针、显微吸管等。细针可能减少对胚胎的损伤，但可能需要更多尝试或移液次数；粗针可能更容易获取细胞，但损伤风险稍高。需要找到平衡点。
   • 精确的胚胎固定： 使用合适的胚胎固定平台（如PVP溶液、专用固定夹），确保囊胚在操作过程中稳定，便于准确穿刺目标区域（通常是滋养层）。
   • 控制穿刺次数和位置： 尽量减少穿刺次数，避免反复穿刺同一区域，以减少机械损伤和细胞丢失。通常建议穿刺2-4个滋养层区域。
   • 优化移液操作： 在将活检针内的细胞转移到培养皿或离心管时，使用合适的吸液管（如Fire-polished吸管），轻柔操作，避免细胞粘壁或被吸走。可以加入少量预温的培养液辅助转移。

2. 改进胚胎培养和活检时机：

   • 优化囊胚培养体系： 确保培养环境（培养基成分、气体环境、渗透压等）最适宜囊胚发育和滋养层细胞生长，使滋养层细胞数量充足、结构清晰。
   • 精准选择活检时机： Day 5/6的囊胚通常滋养层细胞数量较多。但过于成熟（如孵化晚期）或发育不良的囊胚可能细胞量不足或质量差。需要根据囊胚的形态学评分（如AHR分级）和发育状态选择最佳活检窗口。

3. 辅助技术（探索中）：

   • 囊胚辅助孵化（BAI）： 对于孵化不良的囊胚，BAI可能有助于改善囊胚形态，并可能使滋养层细胞更容易获取。但需谨慎评估其对后续发育和PGT结果的影响。
   • 非侵入性方法（未来方向）： 如基于光学相干断层扫描（OCT）或其他成像技术的引导活检，理论上可以更精确地定位滋养层进行取样，减少对其他细胞类型的损伤，但这技术尚在发展中。

二、 提高细胞质量（Quality）

1. 严格筛选活检候选胚胎：

   • 基于形态学的高标准： 选择发育潜能良好、形态学特征清晰的囊胚（如优质A/B级囊胚）进行活检。形态学差的胚胎其滋养层细胞可能数量不足、活力差或异质性高。
   • 评估囊胚孵化状态： 选择部分孵出或完全孵出的囊胚进行活检，通常认为这些囊胚的滋养层细胞更易获取且活性可能更高。

2. 优化活检后的细胞处理：

   • 快速转移： 活检操作完成后，迅速将含有细胞的液体转移到含有预温培养液的培养皿或离心管中，减少细胞在体外暴露于非适宜环境的时间。
   • 洗涤细胞： 使用合适的培养液轻柔洗涤1-2次，去除血液、培养基残留和其他杂质，但动作必须轻柔，避免细胞脱落。
   • 细胞计数和活力评估： 在进行遗传检测前，使用显微镜或细胞计数仪（如CCK-8、台盼蓝染色法）评估细胞数量和活力，确保满足检测要求。如果细胞数量或活力不足，可能需要考虑放弃该胚胎的PGT检测或寻求其他解决方案（如冷冻后再次评估）。

3. 改进遗传检测技术：

   • 选择合适的检测方法： 根据临床需求（如筛查非整倍体、单基因病等）和细胞数量选择最合适的PGT技术（如NGS、Sanger测序）。NGS技术对细胞数量和纯度的要求相对较高，但能提供更全面的信息。
   • 优化样本制备流程： 确保从细胞获取到DNA/RNA提取、扩增（如果需要）再到测序/分析的全流程严格规范，减少人为污染和降解。

4. 减少细胞损伤：

   • 轻柔操作： 整个活检过程，包括固定、穿刺、移液等，都应尽量轻柔，减少机械压力对细胞的损伤。
   • 避免接触不良物质： 确保所有接触细胞的器械和培养液都经过严格灭菌和优化，避免化学损伤。

三、 人员和技术培训

• 专业培训： 对操作人员进行系统的显微镜操作、胚胎学知识和活检技术的培训与考核，确保操作规范性和一致性。
• 持续学习： 关注最新的技术进展和研究成果，不断优化操作流程。

总结:

解决PGT-AS活检中的细胞获取和质量问题需要从胚胎选择、活检操作技巧、细胞处理、遗传检测技术优化以及人员培训等多个方面综合入手。这是一个系统工程，需要实验室的持续改进和经验积累。核心目标是在最大限度地减少对胚胎损伤的前提下，获取足够数量和高质量、纯度高的滋养层细胞，为准确的遗传学分析奠定基础，最终提高PGT的成功率和妊娠率。